Analyse du locus CYP21A2 par séquençage nouvelle génération : vers un nouveau standard pour le diagnostic moléculaire des blocs en 21-hydroxylase ?
F. Chasseloup*a (Dr), L. Laddadab (Mme), A. Proustb (Dr), A. Guiochon-Mantelc (Pr), P. Kamenickyd (Pr), J. Youngd (Pr), C. Bouvattiere (Dr), J. Bouligandc (Dr)
a Université Paris-Saclay, Inserm « Physiologie et Physiopathologie Endocriniennes », Le Kremlin-Bicêtre, FRANCE ; b Université Paris-Saclay, AP-HP, Hôpital de Bicêtre, Service de Génétique Moléculaire,, Le Kremlin-Bicêtre, FRANCE ; c Université Paris-Saclay, Inserm « Physiologie et Physiopathologie Endocriniennes » - AP-HP, Hôpital de Bicêtre, Service de Génétique Moléculaire, Le Kremlin-Bicêtre, FRANCE ; d Université Paris-Saclay, Inserm « Physiologie et Physiopathologie Endocriniennes » - AP-HP, Hôpital de Bicêtre, Service d'Endocrinologie et des Maladies de la Reproduction, Le Kremlin-Bicêtre, FRANCE ; e Université Paris-Saclay, Inserm « Physiologie et Physiopathologie Endocriniennes » - AP-HP, Hôpital de Bicêtre, Service d'Endocrinologie Pédiatrique, Le Kremlin-Bicêtre, FRANCE
* fanny.chasseloup@u-psud.fr
Contexte : Le déficit en 21-hydroxylase (D21OH) par mutation de CYP21A2 est une cause très fréquente d’hyperplasie congénitale des surrénales, une des maladies génétiques les plus fréquentes en France. Peu de laboratoires réalisent cette analyse, rendue compliquée par une région génomique très complexe avec un pseudogène (CYP21A1P). Le séquençage par Sanger après amplification spécifique reste la seule méthode communément utilisée et elle doit être combinée à une MLPA afin de rechercher des délétions/réarrangement du locus. L’analyse par diverses méthodes de séquençage nouvelle génération (NGS), théoriquement transposable dans de nombreux laboratoires, n’était à ce jour pas fiable.
Objectif : Développer et valider une méthode fiable, rapide et reproductible d’analyse de CYP21A2 par NGS.
Méthode : L’amplification spécifique du locus CYP21A2 est assurée par une unique PCR longue (4kb). Le locus est ensuite entièrement séquencé par NGS Illumina et analysé par un protocole bioinformatique spécifique.
Résultats : Nous avons analysé 100 patients avec D21OH avec cette méthode originale, qui a été comparée à la technique de référence Sanger combinée à la MLPA. Cette comparaison des méthodes (concordance>90%) a permis d’optimiser le protocole afin d’améliorer la détection des variants substitutions ou insertions/délétions. La détection des anomalies du nombre de copies est en cours d’optimisation et permettra éventuellement de s’affranchir de la MLPA.
Conclusion : Nous décrivons une méthode rapide et robuste d’analyse de CYP21A2 par NGS permettant l’analyse simultanée chez plusieurs patients du locus entier. Par sa facilité de mise en œuvre, cette méthode serait utilisable dans la plupart des laboratoires de génétique.
L’auteur n’a pas transmis de déclaration de conflit d’intérêt.